亚洲综合色区另类aⅴ_好男人www在线社区_青娱视觉盛宴免费国产在线_国产极品熟女沙发内射AV_а天堂8中文最新版在线官网_亚洲av无码日韩av无码导航_日本大尺度吃奶呻吟视频_四虎精品免费永久免费视频

體外細胞毒性

體外細胞毒性試驗是一種在離體狀態(tài)下模擬生物體生長環(huán)境，檢測醫(yī)療器械及生物材料接觸機體組織后所發(fā)生的細胞溶解、抑制細胞生長和其他毒性作用的體外試驗。

體外細胞毒性試驗是醫(yī)療器械生物學(xué)評價體系中最重要的檢測指標之一，幾乎也是醫(yī)療器械及生物材料臨床應(yīng)用前的必選項目。

體外細胞毒性試驗?zāi)康暮鸵饬x:

　　目的：評級醫(yī)療器械和生物材料致細胞毒性反應(yīng)的潛在性，并預(yù)測最終生物體應(yīng)用時的組織細胞反應(yīng)。通過體外細胞培養(yǎng)技術(shù)，可檢測供試品接觸細胞后細胞發(fā)生生長抑制、功能改變、細胞溶解、死亡或其他毒性反應(yīng)。

　　意義：可在短時間內(nèi)較經(jīng)濟、簡便地篩選出批量供試品的細胞毒性，它為動物試驗的進行與否提供了先決條件，對新型醫(yī)療器械及生物材料的研制和應(yīng)用提供了重要保證。

體外細胞毒性試驗方法:

　　體外細胞毒性試驗具有通用性，可以適用于各種醫(yī)療器械和生物材料的評價，GB/16886.5標準不是規(guī)定一個單一的試驗方法，而是規(guī)定一個試驗方案，需要在一系列試驗步驟中判斷，以選出最合適的試驗，試驗主要分三類：浸提液試驗，直接接觸試驗和間接接觸試驗（瓊脂擴散試驗和濾膜擴散試驗)。

　　由于醫(yī)療器械產(chǎn)品和材料的多樣性，植入機體環(huán)境中的變異性，與機體相互作用的復(fù)雜性等因素，選擇郎種方法進行體外細胞毒性評價，不同的試驗人員會有不同的選擇。當一個評價項目具有多個試驗方法時，應(yīng)考慮試驗的原理、靈敏性、可選性、可定量性、重現(xiàn)性、試驗材料的適用性及局限性等因素進行選擇。

　　例如浸提液法適合檢測溶出物的毒性；直接接觸法對材料的細胞毒性敏感性最高，可檢測出材料微弱的細胞毒性，間接接觸法中的瓊脂擴散試驗適合于毒性大的大批量材料篩選，濾膜擴散法適合于小分子量毒性材料的評價。

　　以上各種方法因原理不同，各有特點，應(yīng)根據(jù)試驗材料本身理化性質(zhì)、毒性作用強弱及其用途，正確地選擇試驗方法。

MTT法：

將配制好的1×105/mL細胞懸液接種于96孔板，設(shè)空白對照、陰性對照、陽性對照和供試品組，每組各設(shè)至少6孔，每孔接種100uL細胞懸液，置CO2培養(yǎng)箱（含體積分數(shù)5%二氧化碳氣體）37℃培養(yǎng)24h。

培養(yǎng)24h后棄去原培養(yǎng)液，空白對照組加入新鮮細胞培養(yǎng)液，陰性對照組加入陰性對照品浸提液，陽性對照組加入陽性對照溶液或陽性對照品浸提液，供試品組分別加入100uL不同濃度的樣品浸提液（100%、75%、50%、25%），置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h。

更換培養(yǎng)液24h后，置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。每孔加入50uL質(zhì)量濃度為1mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2h后棄去孔內(nèi)液體，加入100uL異丙醇，置振蕩器上振蕩，在酶標儀570nm和650nm波長下測定吸光度，計算相對增殖率（RGR）。

直接接觸法:

將已培養(yǎng) 48h～72h 生長旺盛的細胞用消化液消化后加入細胞培養(yǎng)液，用移液槍吹打混勻后在顯微鏡下計數(shù)，將細胞懸液配制成密度 1.0×105/mL，接種于直徑 35mm 培養(yǎng)皿，每皿 2mL，共 9 皿。置 CO2培養(yǎng)箱 （5%CO2，37℃，＞90%濕度）培養(yǎng)至近匯合單層細胞形成。 

棄去原培養(yǎng)液。加入 2mL 新鮮培養(yǎng)基，在培養(yǎng)皿中央部位的細胞層上輕輕放置一片供試樣品，共 3 皿。 同法操作陰性對照、陽性對照各 3 皿。置 CO2培養(yǎng)箱（5%CO2，37℃，＞90%濕度）繼續(xù)培養(yǎng) 24h。 

培養(yǎng)結(jié)束后，于顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、空泡形成、脫落、細胞溶解和膜完整性等方面的變化，根據(jù)以下標準判斷試驗樣品分級，分級大于 2 級時被認為有細胞毒性作用。

瓊脂擴散法:

將已培養(yǎng)48h～72h生長旺盛的細胞用消化液消化后加入細胞培養(yǎng)液，用移液槍吹打混勻后在顯微鏡下計數(shù)，將細胞懸液配制成密度1.0×105/mL，接種于直徑35mm培養(yǎng)皿，每皿2mL，共9皿。置CO2培養(yǎng)箱（5%CO2，37℃，＞90%濕度）培養(yǎng)至近匯合單層細胞形成。

棄去器皿中的培養(yǎng)基，將溶化瓊脂與含血清的新鮮培養(yǎng)基混合,使瓊脂最終質(zhì)量濃度為0.5%～2%,并吸取適宜體積加入至每只培養(yǎng)皿內(nèi)。細胞培養(yǎng)只能使用適合于哺乳動物細胞生長的瓊脂。這種瓊脂/培養(yǎng)基的混合物宜為液態(tài),并且溫度適合于哺乳動物細胞。加入2mL中性紅液并在CO2培養(yǎng)箱孵育30min，孵育后丟棄多余的中性紅液，將試驗樣品的平行試樣小心地放在每只培養(yǎng)皿的固化瓊脂層上,確保試樣覆蓋細胞層表面約十分之一，共3皿。同法操作陰性對照、陽性對照各3皿。置CO2培養(yǎng)箱（5%CO2，37℃，＞90%濕度）繼續(xù)培養(yǎng)24h。 

培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)皿上的試樣小心地從固化瓊脂層取下，于顯微鏡下觀察培養(yǎng)皿中細胞形態(tài)、空泡形成、脫落、細胞溶解和膜完整性等方面的變化，根據(jù)表1判斷試驗樣品分級，分級大于2級時被認為有細胞毒性作用。