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體外細胞毒性

體外細胞毒性試驗具有通用性,廣泛適用于各種醫(yī)療器械和材料的評價。試驗分成:浸提液試驗、直接接觸試驗、間接接觸試驗三類。接觸試驗結(jié)束時,對細胞毒性作用和毒性程度進行評價。

適用產(chǎn)品
  • 醫(yī)用光機電設(shè)備、手術(shù)器械
  • 醫(yī)用材料
  • 植入材料和人工器官
  • 口腔科設(shè)備及材料
  • 介入器材
檢測介紹

體外細胞毒性

體外細胞毒性試驗是一種在離體狀態(tài)下模擬生物體生長環(huán)境,檢測醫(yī)療器械及生物材料接觸機體組織后所發(fā)生的細胞溶解、抑制細胞生長和其他毒性作用的體外試驗。

體外細胞毒性試驗是醫(yī)療器械生物學(xué)評價體系中最重要的檢測指標之一,幾乎也是醫(yī)療器械及生物材料臨床應(yīng)用前的必選項目。

 

體外細胞毒性試驗?zāi)康暮鸵饬x:

  目的:評級醫(yī)療器械和生物材料致細胞毒性反應(yīng)的潛在性,并預(yù)測最終生物體應(yīng)用時的組織細胞反應(yīng)。通過體外細胞培養(yǎng)技術(shù),可檢測供試品接觸細胞后細胞發(fā)生生長抑制、功能改變、細胞溶解、死亡或其他毒性反應(yīng)。

  意義:可在短時間內(nèi)較經(jīng)濟、簡便地篩選出批量供試品的細胞毒性,它為動物試驗的進行與否提供了先決條件,對新型醫(yī)療器械及生物材料的研制和應(yīng)用提供了重要保證。


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體外細胞毒性試驗方法:

  體外細胞毒性試驗具有通用性,可以適用于各種醫(yī)療器械和生物材料的評價,GB/16886.5標準不是規(guī)定一個單一的試驗方法,而是規(guī)定一個試驗方案,需要在一系列試驗步驟中判斷,以選出最合適的試驗,試驗主要分三類:浸提液試驗,直接接觸試驗和間接接觸試驗(瓊脂擴散試驗和濾膜擴散試驗)。

  由于醫(yī)療器械產(chǎn)品和材料的多樣性,植入機體環(huán)境中的變異性,與機體相互作用的復(fù)雜性等因素,選擇郎種方法進行體外細胞毒性評價,不同的試驗人員會有不同的選擇。當一個評價項目具有多個試驗方法時,應(yīng)考慮試驗的原理、靈敏性、可選性、可定量性、重現(xiàn)性、試驗材料的適用性及局限性等因素進行選擇。

  例如浸提液法適合檢測溶出物的毒性;直接接觸法對材料的細胞毒性敏感性最高,可檢測出材料微弱的細胞毒性,間接接觸法中的瓊脂擴散試驗適合于毒性大的大批量材料篩選,濾膜擴散法適合于小分子量毒性材料的評價。

  以上各種方法因原理不同,各有特點,應(yīng)根據(jù)試驗材料本身理化性質(zhì)、毒性作用強弱及其用途,正確地選擇試驗方法。

 

MTT法:

將配制好的1×105/mL細胞懸液接種于96孔板,設(shè)空白對照、陰性對照、陽性對照和供試品組,每組各設(shè)至少6孔,每孔接種100uL細胞懸液,置CO2培養(yǎng)箱(含體積分數(shù)5%二氧化碳氣體)37℃培養(yǎng)24h。

培養(yǎng)24h后棄去原培養(yǎng)液,空白對照組加入新鮮細胞培養(yǎng)液,陰性對照組加入陰性對照品浸提液,陽性對照組加入陽性對照溶液或陽性對照品浸提液,供試品組分別加入100uL不同濃度的樣品浸提液(100%、75%、50%、25%),置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h。

更換培養(yǎng)液24h后,置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。每孔加入50uL質(zhì)量濃度為1mg/mL的MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)2h后棄去孔內(nèi)液體,加入100uL異丙醇,置振蕩器上振蕩,在酶標儀570nm和650nm波長下測定吸光度,計算相對增殖率(RGR)。


直接接觸法:

將已培養(yǎng) 48h72h 生長旺盛的細胞用消化液消化后加入細胞培養(yǎng)液,用移液槍吹打混勻后在顯微鏡下計數(shù),將細胞懸液配制成密度 1.0×105/mL,接種于直徑 35mm 培養(yǎng)皿,每皿 2mL,共 9 皿。置 CO2培養(yǎng)箱 (5%CO2,37℃,>90%濕度)培養(yǎng)至近匯合單層細胞形成。 

棄去原培養(yǎng)液。加入 2mL 新鮮培養(yǎng)基,在培養(yǎng)皿中央部位的細胞層上輕輕放置一片供試樣品,共 3 皿。 同法操作陰性對照、陽性對照各 3 皿。置 CO2培養(yǎng)箱(5%CO2,37℃,>90%濕度)繼續(xù)培養(yǎng) 24h。 

培養(yǎng)結(jié)束后,于顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、空泡形成、脫落、細胞溶解和膜完整性等方面的變化,根據(jù)以下標準判斷試驗樣品分級,分級大于 2 級時被認為有細胞毒性作用。


瓊脂擴散法:

將已培養(yǎng)48h72h生長旺盛的細胞用消化液消化后加入細胞培養(yǎng)液,用移液槍吹打混勻后在顯微鏡下計數(shù),將細胞懸液配制成密度1.0×105/mL,接種于直徑35mm培養(yǎng)皿,每皿2mL,共9皿。置CO2培養(yǎng)箱(5%CO237℃,>90%濕度)培養(yǎng)至近匯合單層細胞形成。

棄去器皿中的培養(yǎng)基,將溶化瓊脂與含血清的新鮮培養(yǎng)基混合,使瓊脂最終質(zhì)量濃度為0.5%2%,并吸取適宜體積加入至每只培養(yǎng)皿內(nèi)。細胞培養(yǎng)只能使用適合于哺乳動物細胞生長的瓊脂。這種瓊脂/培養(yǎng)基的混合物宜為液態(tài),并且溫度適合于哺乳動物細胞。加入2mL中性紅液并在CO2培養(yǎng)箱孵育30min,孵育后丟棄多余的中性紅液,將試驗樣品的平行試樣小心地放在每只培養(yǎng)皿的固化瓊脂層上,確保試樣覆蓋細胞層表面約十分之一,共3皿。同法操作陰性對照、陽性對照各3皿。置CO2培養(yǎng)箱(5%CO2,37℃,>90%濕度)繼續(xù)培養(yǎng)24h。 

培養(yǎng)結(jié)束后,將培養(yǎng)皿上的試樣小心地從固化瓊脂層取下,于顯微鏡下觀察培養(yǎng)皿中細胞形態(tài)、空泡形成、脫落、細胞溶解和膜完整性等方面的變化,根據(jù)表1判斷試驗樣品分級,分級大于2級時被認為有細胞毒性作用。

檢測標準
檢測對象 項目 檢測標準(方法)
通用器械 體外細胞毒性 醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第 5 部分:體外細胞毒性試驗 GB/T 16886.5-2017
醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第 5 部分:體外細胞毒性試驗 ISO 10993-5:2009
醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法 第 2 部分:生物 學(xué)試驗方法 GB/T 14233.2-2005 8
醫(yī)用有機硅材料生物學(xué)評價試驗方法 GB/T 16175-2008 5
其他

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